作者：陳建林、吳莉紅、吳良燕、梁思群、戴娟、沈月單位：柳州市柳鐵中心醫(yī)院案例發(fā)生比較典型，為了避免發(fā)生類似的問題，梳理原因分析過程并整理實驗驗證資料，與大家進行分享。
9月21日下午16:00接班時，值班老師稱當日新冠核酸RT-PCR擴增失敗致使檢驗報告全部未發(fā)，正在準備對標本重新復查。實驗室使用的新型冠狀病毒（2019-nCoV）試劑盒檢測ORF1ab、N基因和RNase P基因。
當天出現(xiàn)異常結(jié)果如下：第2-7列樣本和A7孔位弱陽性對照擴增曲線未出（正常陰性樣本和弱陽性對照內(nèi)參基因都應有擴增，弱陽性對照ORF1ab和N 基因也應有擴增）（圖1），第1列樣本內(nèi)參基因正常檢出，E8孔位弱陽性對照正常檢出(圖2)。
由于時間緊迫，筆者立即參與到原因分析中來。經(jīng)查當日核酸提取儀、熒光定量PCR儀都運作正常且前一天實驗結(jié)果未出現(xiàn)此種情形，初步排除了儀器的原因。由于存在少部分樣本有擴增曲線而大部分樣本擴增失敗，（因提取試劑1塊96深孔板同時提取16份樣本，上機檢測使用的8連管體系放置在相鄰的兩列）從擴增失敗樣本的分布來看可初步排除提取試劑的質(zhì)量問題。據(jù)檢測人員回憶，本次檢測所使用的擴增體系存在混用情況，即有擴增曲線的體系為當天分裝，不出結(jié)果的體系為前一天分裝。由于前一天分裝體系弱陽性對照不出（A7），第一直覺是前一天分裝的擴增體系出現(xiàn)問題。但是，查核前一天分裝體系的批號和保存狀態(tài)與當天一致，并未發(fā)現(xiàn)異常。由于質(zhì)控失控，所有標本需要重新復查。雖然初步排除了提取試劑的質(zhì)量問題，為了萬無一失，實驗人員再次重提核酸進行檢測。鑒于擴增體系分裝的疑點較大，故換人重新分裝擴增體系（批號未變）。檢測后奇怪的事情再次出現(xiàn)，見下圖。第1-5列樣本(使用當天第一次分裝體系)內(nèi)參基因均有曲線（圖3），第6-7列樣本（用當天第二次分裝體系）包括弱陽性對照都未有陽性擴增曲線（圖4），實驗再次失敗。難道是同一批號的擴增試劑中有部分存在質(zhì)量問題？（在此之前出現(xiàn)過一次擴增試劑酶混合液量不足的案例）再次核對試劑的批號、保存狀態(tài)以及試劑批號更換性能驗證結(jié)果均未見異常，綜合判斷此種情形存在的概率非常低。這時再次將疑點轉(zhuǎn)移到試劑的分裝上來。為了進一步明確問題所在，筆者對擴增體系進行了第三次分裝，同時為了排除一切干擾因素，本次分裝棄用之前的方法（體系先混在小容器中，再用排槍快速分裝），改用20ul單通道加樣槍在試劑盒原管中混合體系進行分裝，同時設計對照試驗明確原因所在。擴增結(jié)果詳見圖5-圖8。本次試驗第1-4列和第6列為筆者分裝體系（圖5，圖6），第5列為當天第二次分裝體系（圖8），其中第1列和第5列對應孔位所加模板（重新抽提）一致（圖7，圖8），B6，D6，F(xiàn)6為同一批號不同批次分裝試劑盒的弱陽性對照（圖5），分別來自筆者分裝試劑盒、當天第二次分裝試劑盒、已檢測為弱陽性的試劑盒。從上述結(jié)果可以看出，不同試劑盒中的弱陽性對照均有擴增，證明筆者分裝試劑盒無質(zhì)量問題，當天第二次分裝試劑盒的弱陽性對照也無質(zhì)量問題，結(jié)合圖4擴增結(jié)果，圖7、圖8相同模板第1列有擴增而第5列無擴增，可以判定當天第二次分裝的體系也存在問題。綜上分析，同樣的試劑盒，分裝方法不同導致實驗失敗，大家將問題一致指向了分裝時所使用的承裝體系的透明小蓋。難道是因為透明小蓋上存在某種抑制物，抑制了PCR反應？圖9 使用排槍給提取試劑預加蛋白酶K的透明小蓋（容器） 圖10使用排槍分裝體系時混合擴增體系各成份的透明小蓋（容器）由此，筆者逐一詢問了前一天值班人員和當天值班人員提取試劑和擴增試劑準備的操作細節(jié)，發(fā)現(xiàn)前一天值班人員分裝體系時誤用了盛裝蛋白酶K的專用透明小蓋來盛裝擴增體系，當天值班人員在進行復查時誤用承裝擴增體系的透明小蓋來盛裝蛋白酶K準備提取試劑。此時，失控原因終于有了眉頭，也能很好的解釋圖1、圖4和圖8為什么擴增失敗，尤其是當天第二次體系分裝時雖然規(guī)范操作，但分裝人員并不知情透明小蓋已被蛋白酶K污染，以致最終實驗失敗。幸運的是當天第一次體系分裝時專用透明小蓋尚未被污染，分裝的體系得以幸免。思路逐漸清晰，為了初步驗證上述判斷，筆者對已分裝體系人為的進行了微量的蛋白酶K污染，看抑制效應能否再現(xiàn)，結(jié)果見圖11、圖12。為了進一步明確蛋白酶K的抑制效應和抑制濃度，筆者對蛋白酶K（原液濃度30mg/ml）進行95℃，10min滅活，同時對蛋白酶K的終濃度進行了梯度稀釋，實驗設計如表1。對上述不同干預濃度進行3個復孔擴增，模板為弱陽性對照（5ul/孔），擴增結(jié)果如下表2和圖13-圖20。
表2 不同干預濃度樣本的擴增結(jié)果（Ct值）
從上述結(jié)果我們可以看出，滅活后的蛋白酶K已不存在抑制效應(圖17)，進一步印證了實驗失敗的最重要的原因-蛋白酶K殘留。從擴增曲線來看，終濃度5.689 mg/ml蛋白酶K可以完全抑制擴增反應(圖13)。雖然低濃度的蛋白酶存在時（如低于0.5689mg/ml），從Ct值來看目的基因和內(nèi)參基因基本不受影響(表2，圖.18)，但從擴增曲線對比來看，ORF1ab基因在終濃度0.5689mg/ml蛋白酶K存在時仍有顯著的抑制效應，只是尚未能完全抑制擴增反應，N基因在終濃度0.005689mg/ml蛋白酶K存在時，擴增曲線 “指數(shù)期”較為平坦熒光強度較低，仍存在些許抑制效應，只是效應較?。▓D14、圖15、圖16、圖17）。那么問題又來了，蛋白酶K到底是如何影響RT-PCR反應的呢？蛋白酶K（EC3.4.21.14）由一條肽鏈組成，包含277個氨基酸殘基，相對分子質(zhì)量為28.9kDa屬絲氨酸蛋白酶類，蛋白酶K家族包含了各種真菌、酵母及革蘭氏陰性細菌分泌的細胞內(nèi)肽酶。1974年，Wolfgang Ebeling等利用沉淀、離子交換層析和凝聚層析等方法在林伯氏白色念球菌的培養(yǎng)基中分離純化出蛋白酶K。因能合成該種蛋白酶的微生物能在以角蛋白(Keratin)為唯一碳氮源的環(huán)境中生長，即能夠消化角蛋白，因此被命名為蛋白酶K。
與其它的蛋白酶相比較，蛋白酶K具有高活力和高穩(wěn)定性，其酶活性不會被尿素、SDS和EDTA等變性劑抑制，且在高溫、高鹽或較高的pH等條件下，蛋白酶K仍能保持較高活性。因該酶在較廣的pH范圍(4～12.5)內(nèi)及高溫(50～70℃)均有活性，在提取DNA和RNA的緩沖液中具有很高的活性，可用于質(zhì)粒或基因組DNA、RNA的分離，是DNA提取的關鍵試劑。在病毒核酸檢測中，蛋白酶K是病毒采樣液中的重要組分之一，蛋白酶K可以裂解病毒的外殼蛋白并使其失活，這樣在運輸和檢測階段更安全；另外，蛋白酶K還可以降解RNA酶，防止病毒RNA的降解，有利于核酸檢測。
從擴增程序中我們不難發(fā)現(xiàn)，在逆轉(zhuǎn)錄階段，溫度設置為50℃且持續(xù)10min，而此階段正好為蛋白酶K發(fā)揮效應提供了最適溫度。由此判斷，擴增體系中的逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA 聚合酶均在此階段遭受了不同程度的降解，從而出現(xiàn)了案例中出現(xiàn)的抑制效應。
通過此失控案例，筆者對日常質(zhì)量控制和實驗室管理進行了總結(jié)和反思：
PCR日常工作中，由于質(zhì)控樣品和標本同時檢測同時出結(jié)果，一旦出現(xiàn)失控或結(jié)果異常，原因分析和復查將非常的耗時耗力，復查的平均時長少則持續(xù)80-90min，多則需要4-5h，如果中間再次出差錯，將會造成嚴重的時間浪費。
本次失控原因查找過程中，通過觀察反應曲線，雖然很快定位是前一天分裝的體系出現(xiàn)問題，但未能明確是體系分裝（體系混合盛裝）的干擾，在后續(xù)復查中再次出現(xiàn)嚴重的操作污染，導致后續(xù)分裝的體系擴增失敗、附帶弱陽性對照不出，造成了所有標本二次復查的窘境。不僅造成試劑的損耗和時間的浪費，差一點影響到失控原因的判斷，所謂教訓慘痛。因此，在PCR過程中，操作人員需要細心、細心、再細心，同時也提醒我們對日常的培訓要深入細節(jié)，避免“細節(jié)性差錯”重復發(fā)生。
在檢驗過程失控后，我們要學會去深挖失控背后的根本原因，不僅要知其然還要知其所以然。本案例中，通過查閱說明書，實驗驗證和回顧性分析，推斷出蛋白酶K抑制擴增反應的關鍵步驟，最終明確了蛋白酶K抑制擴增反應的機制。雖然過程比較曲折，但為后續(xù)的工作積累了寶貴的經(jīng)驗。讓“抑制物”這一概念有了非常深的認識，這將對后續(xù)的工作將起到非常深刻的警示作用。
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